單分子質(zhì)量光度系統(tǒng)—TwoMP

單分子質(zhì)量與組分分析

質(zhì)量光度法（Mass Photometry）是一種革命性的分析生物分子的新方法，即超微量單分子質(zhì)量和分布測(cè)量分析法。它能夠在溶液中精確測(cè)量單個(gè)分子的質(zhì)量，不需要任何偶聯(lián)固化或者標(biāo)記標(biāo)簽，在天然狀態(tài)下，完成對(duì)生物分子的分析。這種方法為生物分析和生物分子功能研究開(kāi)辟了新的可能性。

★  無(wú)標(biāo)記修飾；

★  保持結(jié)構(gòu)完整性和活性； 

★  測(cè)量只需要幾微升的樣品；

★  設(shè)計(jì)緊湊的臺(tái)式儀器，無(wú)特殊安裝要求；

★  軟件自動(dòng)控制采集過(guò)程，并在幾分鐘內(nèi)進(jìn)行質(zhì)量分析；

★  直觀地解釋質(zhì)量分布的結(jié)果，而不需要任何經(jīng)驗(yàn)和知識(shí)；

★  準(zhǔn)確測(cè)量在溶液（而不需真空）中的蛋白分子質(zhì)量；    

★  單分子分析，可靠區(qū)分樣品中所有已知和未知組分，高精度捕獲高豐度和低豐度分子；

★  快速、簡(jiǎn)單、最小樣本量：納米濃度下的微升樣品體積，幾分鐘內(nèi)獲得結(jié)果，寬質(zhì)量范圍和高動(dòng)態(tài)范圍；

這么優(yōu)秀的分子分析技術(shù)，您還不動(dòng)心么？

質(zhì)量光度法Mass photometry的技術(shù)背景：

質(zhì)量光度學(xué)建立在干涉反射顯微鏡和干涉散射顯微鏡的原理之上。牛津大學(xué)的Kukura教授團(tuán)隊(duì)證明了單分子在觀察界面上散射的微小光量能夠被可靠地檢測(cè)到，可以用于計(jì)算溶液中的分子數(shù)量，更重要的是，它與分子質(zhì)量直接相關(guān)，可以用于測(cè)量分子的質(zhì)量。

2018年，牛津大學(xué)的Philipp Kukura團(tuán)隊(duì)宣布他們開(kāi)發(fā)的一種全新技術(shù)：質(zhì)量光度法（Mass photometry），通過(guò)單分子散射光的方式測(cè)量單分子的質(zhì)量。這種方法提可以精確測(cè)量溶液中單個(gè)分子的質(zhì)量——處于原始狀態(tài)、無(wú)需標(biāo)記，提供了一種新的分析生物分子的方法，為生物分析和研究生物分子的功能開(kāi)辟了新的途徑。牛津大學(xué)（University of Oxford）迅速將其業(yè)務(wù)剝離出來(lái)，成立了英國(guó)Refeyn公司，并推出質(zhì)量光度系統(tǒng)（單分子質(zhì)量分析系統(tǒng)）。

圖1：質(zhì)量光度法原理。附著在測(cè)量界面上的分子散射的光干擾了該界面反射的光。干涉對(duì)比度與質(zhì)量成線性關(guān)系。
 

英國(guó)Refeyn公司的質(zhì)量光度系統(tǒng)One MP于2019年3月上市，2020年進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)，2021年，推出更新型號(hào)的產(chǎn)品---質(zhì)量光度系統(tǒng)的二代機(jī)，Two MP，在硬件和軟件上均有升級(jí)。2022年2月，北京佰司特中標(biāo)北京生命科學(xué)研究所質(zhì)譜招標(biāo)采購(gòu)項(xiàng)目（一臺(tái)質(zhì)量光度系統(tǒng)二代機(jī)）TwoMP，其分辨率和穩(wěn)定性，相對(duì)之前的質(zhì)量光度系統(tǒng)的一代機(jī)OneMP，有大幅提升。北京佰司特借此機(jī)會(huì)，也為國(guó)內(nèi)科研人員提供更有更好的產(chǎn)品和服務(wù)。

2021年開(kāi)始，北京佰司特科技有限責(zé)任公司獲得中國(guó)大陸地區(qū)的代理權(quán)；2023年開(kāi)始，北京佰司特科技有限責(zé)任公司負(fù)責(zé)英國(guó)Refeyn公司的質(zhì)量光度系統(tǒng)在國(guó)內(nèi)研究單位的市場(chǎng)推廣、產(chǎn)品宣傳、銷(xiāo)售和售后工作。

全新的英國(guó)Refeyn公司的單分子質(zhì)量光度系統(tǒng)—TwoMP，將質(zhì)量光度法（Mass photometry）技術(shù)引入到日常的實(shí)驗(yàn)室中，以超高的靈敏度、速度、準(zhǔn)確度和簡(jiǎn)單性來(lái)表征你感興趣的分子，是監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)純化、優(yōu)化樣品、研究蛋白質(zhì)功能和相互作用的理想儀器。所有測(cè)量都可在各種各樣的天然緩沖液中逐個(gè)分子地完成，還不需要標(biāo)簽，就可以直觀地解釋質(zhì)量分布結(jié)果，且無(wú)需任何先驗(yàn)知識(shí)。

粒子散射的光與粒子體積和折射率成線性關(guān)系。由于蛋白質(zhì)的光學(xué)性質(zhì)和密度只有百分之幾的變化，它們的散射信號(hào)與它們的序列質(zhì)量成正比，這使得在高精度和大質(zhì)量范圍內(nèi)用光來(lái)“稱量"單個(gè)分子成為可能。許多生物分子（糖蛋白、核酸或脂類）的散射信號(hào)與質(zhì)量的相關(guān)性是成立的，使得質(zhì)量光度法能夠成為溶液中生物分子的通用分析工具。     

圖2：質(zhì)量光度法測(cè)量溶液中蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)組合的分子質(zhì)量。通過(guò)校準(zhǔn)，質(zhì)量光度法可以高精度（平均2%）測(cè)量未知物質(zhì)的質(zhì)量。

質(zhì)量光度法Mass photometry的技術(shù)路線：

質(zhì)量光度法（一）-iSCAT法觀察單個(gè)分子
質(zhì)量光度法（MP法）是一種基于iSCAT法的單分子觀察方法。
如果您從樣品底部照射激光束并預(yù)先聚焦載玻片的上表面，您將觀察到來(lái)自載玻片的反射光。
如果在觀察這種狀態(tài)時(shí)被測(cè)物體（蛋白質(zhì)分子等）與載玻片接觸，則折射率只會(huì)在該部分發(fā)生局部變化，并且來(lái)自被測(cè)物體的散射光也會(huì)被檢測(cè)到。
在普通顯微鏡模式下無(wú)法觀察到這種現(xiàn)象，但可以通過(guò)執(zhí)行 SNR（短噪聲限制信噪比）分析來(lái)捕獲圖像。

質(zhì)量光度法（二）-SNR分析處理
為了從獲取的原始圖像中去除噪聲，取原始圖像之間的差異并進(jìn)一步去除噪聲。
這個(gè)工作叫做SNR（Short-noise limited信噪比）分析（其實(shí)也是多幀合并）。
幀數(shù)約為每秒100幀，并不斷進(jìn)行分析。
一旦檢測(cè)到測(cè)量對(duì)象，它將被覆蓋并且不計(jì)入下一幀。

質(zhì)量光度法（三）-分子計(jì)數(shù)
取決于散射強(qiáng)度的圖像對(duì)比度是從測(cè)量對(duì)象的捕獲圖像中獲得的。此時(shí)，通過(guò)圖像分析確定對(duì)比度區(qū)域，而不是平均對(duì)比度，并計(jì)算總量。
自動(dòng)保存每幀獲取的測(cè)量對(duì)象圖像的“數(shù)量"和“總對(duì)比度"。保存的數(shù)據(jù)可以擴(kuò)展為“對(duì)比數(shù)"分布。

質(zhì)量光度法（四）-對(duì)比分子量轉(zhuǎn)換
獲得的對(duì)比度總量與其分子量成線性比例。
通過(guò)測(cè)量已知分子量的樣品，創(chuàng)建校準(zhǔn)曲線并使用它，對(duì)比度將轉(zhuǎn)換為分子量。

質(zhì)量光度法Mass photometry技術(shù)的特點(diǎn)：

      ★  準(zhǔn)確測(cè)量蛋白分子在溶液中的真實(shí)、天然行為；
      ★  適用于在各種緩沖液中，與膜蛋白相容；
      ★  無(wú)標(biāo)簽標(biāo)記，無(wú)需修飾樣品或干擾分子表面；
      ★  可檢測(cè)樣本中所有亞群體的信息：?jiǎn)畏肿臃治瞿軌蚩煽康貐^(qū)分已知和未知樣品成分，無(wú)需先驗(yàn)知識(shí)；
      ★  單分子計(jì)數(shù)：以高精度捕獲高豐度和低豐度分子；
      ★  寬質(zhì)量范圍和高動(dòng)態(tài)范圍；

      ★  一種分析形式可提供多個(gè)結(jié)果；
      ★  保持同質(zhì)性、結(jié)構(gòu)完整性和活性；
      ★  快速、簡(jiǎn)單、最小樣本量：納摩濃度下，微升體積，幾分鐘內(nèi)獲得結(jié)果；

質(zhì)量光度系統(tǒng)TwoMP儀器的特點(diǎn)：

      ★  緊湊的臺(tái)式儀器，安裝要求低。測(cè)量只需要幾微升的樣品、和干凈、高質(zhì)量的蓋玻片，幾分鐘內(nèi)可獲得結(jié)果；
      ★  直觀高效——軟件自動(dòng)控制采集過(guò)程，并在幾分鐘內(nèi)完成質(zhì)量分析。您可以直觀地解釋質(zhì)量分布結(jié)果，而無(wú)需任何先驗(yàn)知識(shí)；
      ★  精確性——由于其高靈敏度，非常適合在生理（低）濃度下進(jìn)行測(cè)量，而單分子計(jì)數(shù)技術(shù)固有的高動(dòng)態(tài)范圍確保低豐度分子仍能被準(zhǔn)確捕獲。質(zhì)量光度法能輕松量化不同種類的蛋白質(zhì)分子，具有高分辨率和重復(fù)性；
   

質(zhì)量光度系統(tǒng)TwoMP儀器的參數(shù)：

※ 原理：干涉光散射，無(wú)需標(biāo)記

※ 質(zhì)量范圍：30kDa – 5MDa

※ 測(cè)量精度：±2% @ 10 nM

※ 單次測(cè)量質(zhì)量誤差：±5% @ 10 nM

※ 分辨率（FWHM）：25kDa @ 66kDa，60KDa @ 660 kDa

※ 濃度范圍：100pM - 100nM（粒子濃度）

※ 靈敏度：< 1ng蛋白質(zhì)

※ 樣品體積：5 - 20 μ l

※ 幀率（標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置）：1 kHz（原始），100 Hz（集成）

※ 視場(chǎng)：4 x 11µm （@ 500 Hz）至12 x 17µm（@ 135 Hz）

※ 波長(zhǎng)：488 nm

※ 像素尺寸：12nm

光學(xué)方法檢測(cè)大分子的分子量

※ 測(cè)量的分子量范圍廣泛，從 30 kDa 到5MDa

※ 蛋白質(zhì)寡聚化/片段化

※ 抗原抗體反應(yīng)、化學(xué)計(jì)量學(xué)參數(shù)

※ AAV等病毒載體的滿載/空載比

※ DNA Ladder的分子量、多糖的分子量

天然狀態(tài)下快速完成測(cè)量

※ 兼容各種溶液

※ 無(wú)需標(biāo)記，無(wú)需固定、無(wú)需樣品前處理

※ 測(cè)量過(guò)程儀器與樣品非接觸

※ 整個(gè)測(cè)量過(guò)程只需要幾分鐘

樣品需求量非常少

※ 蛋白質(zhì)（<1 MDa）：1 nM 至 2 μL，<1 ng

※ 病毒載體（> 1 MDa）：0.1 nM 至 2 uL

 應(yīng)用領(lǐng)域：

      ★  樣品表征 Sample characterization；

樣品的純度和穩(wěn)定性是成功的生化和結(jié)構(gòu)研究的關(guān)鍵因素。在制藥生產(chǎn)的背景下，蛋白質(zhì)的純度是特別重要的，特別是隨著蛋白質(zhì)類產(chǎn)品如生物制劑的日益流行。

質(zhì)量光度系統(tǒng)提供了在單個(gè)分子水平上樣品異質(zhì)性的快速評(píng)估，使用最小的樣品體積和在幾分鐘內(nèi)。通過(guò)質(zhì)量光度系統(tǒng)獲得的質(zhì)量分布提供了樣品中現(xiàn)有物種的直接信息，由于條件變化而產(chǎn)生的任何變化都可以用于樣品優(yōu)化。

      ★  蛋白質(zhì)的寡聚化 Protein oligomerization；

許多生物系統(tǒng)的一個(gè)關(guān)鍵特征是蛋白質(zhì)自組裝成特定的四級(jí)結(jié)構(gòu)，這往往決定和調(diào)節(jié)它們的功能。蛋白質(zhì)低聚化的評(píng)估對(duì)于詳細(xì)了解復(fù)雜的生物過(guò)程是至關(guān)重要的。在這種情況下，分子質(zhì)量是一個(gè)重要的參數(shù)，因?yàn)樗鳛榈途刍闹苯佣攘俊?/span>

質(zhì)量光度系統(tǒng)提供了高分辨率的分子質(zhì)量分布與單分子靈敏度。這使得我們的技術(shù)能夠有效地檢測(cè)出占主要樣本總數(shù)不到1%的稀有物種。

      ★  大分子組裝 Macromolecular assemblies；

在分子自組裝中，分子或分子的一部分在沒(méi)有外部因素的情況下自發(fā)形成有序結(jié)構(gòu)。大分子組合包括多種蛋白質(zhì)，而且通常包含其他分子，如DNA、RNA、糖和/或脂類。大分子復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的組裝是一個(gè)高度調(diào)控的多步驟過(guò)程。質(zhì)量光度系統(tǒng)能夠高效、準(zhǔn)確地表征這些復(fù)雜的粒子，使新型超分子結(jié)構(gòu)的工程具有巨大的醫(yī)學(xué)研究潛力。

      ★  生物分子間相互作用 Biomolecular interactions；

生物分子之間的相互作用在每個(gè)生物過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。質(zhì)量光度系統(tǒng)非常適合于定量低濃度下的相互作用，其主要優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)溶液中存在的生物復(fù)合物。分子質(zhì)量是反映生物分子和生物分子復(fù)合物的同質(zhì)性、結(jié)構(gòu)完整性和活性等多種性質(zhì)的通用讀數(shù)。這使得質(zhì)譜光度法不僅可以用于簡(jiǎn)單的純度測(cè)定，還可以用于活性和結(jié)合性評(píng)估，提供了獨(dú)特水平的數(shù)據(jù)完整性和其他類似技術(shù)的可比性。

用戶評(píng)價(jià)

質(zhì)量分布是蛋白質(zhì)樣品相對(duì)純度和穩(wěn)定性的基本特征，可作為蛋白質(zhì)純度、復(fù)雜組裝、聚集或各種緩沖液中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的直觀讀數(shù)。監(jiān)測(cè)質(zhì)量可以指導(dǎo)緩沖條件的優(yōu)化，避免蛋白質(zhì)聚集或促進(jìn)蛋白質(zhì)復(fù)合物的穩(wěn)定性和組裝。單分子水平上的質(zhì)量測(cè)量為分子相互作用的穩(wěn)態(tài)分析提供了一種直接的方法。由于其高靈敏度，質(zhì)量光度系統(tǒng)TwoMP非常適合在生理（低）濃度下進(jìn)行測(cè)量，而單分子計(jì)數(shù)技術(shù)固有的高動(dòng)態(tài)范圍確保低豐度分子仍能被準(zhǔn)確捕獲。

英國(guó)Refeyn公司營(yíng)銷(xiāo)官M(fèi)atthias Langhorst表示，該工具的應(yīng)用范圍從簡(jiǎn)單的純度檢測(cè)（質(zhì)量峰的數(shù)量可顯示樣本中有多少種蛋白質(zhì)），到更復(fù)雜的分析，例如在不同條件下分析生物分子組裝行為等。

在麻省理工學(xué)院研究細(xì)胞核孔復(fù)合體的Thomas Schwartz是該裝置的早期測(cè)試者，他一聽(tīng)說(shuō)質(zhì)量光度系統(tǒng)就聯(lián)系Kukura：“這臺(tái)儀器有價(jià)值的地方在于，我們可以觀察復(fù)雜的蛋白質(zhì)-大分子復(fù)合物，找出混合物中的成分，是否能檢測(cè)出任何與穩(wěn)定性有關(guān)的問(wèn)題。"“在典型的工作流程中，這是一個(gè)非常耗時(shí)的過(guò)程。"

“這些原理并不新鮮，但這種新裝置的實(shí)現(xiàn)非常聰明和強(qiáng)大，因?yàn)樗梢詼y(cè)量一個(gè)場(chǎng)中的每一個(gè)粒子。非常強(qiáng)大，具有潛在的革命性。"